摘要：目的 通过比较《美国药典》、《欧洲药典》及《英国药典》检测甲氨蝶呤有关物质不同的方法，探讨使用合适的高效液相色谱法测定其有关物质。方法 采用反相高效液相色谱法，结果 按上述三国药典不同方法均能检测其目前有关物质。结论 《美国药典》的检测方法简洁、高效，可操作性强。
关键词：高效液相色谱法；甲氨蝶呤；有关物质

甲氨蝶呤为目前临床上常用的较好的广谱抗肿瘤药物，近十多年来临床上采用大剂量的甲氨蝶呤，同时辅以亚叶酸钙作为解毒剂，治疗各种恶性肿瘤，使疗效大为提高。特别对使用小剂量无效的肿瘤，应用较大剂量时，能取得良好的疗效。如对转移性骨肉瘤、恶性淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、乳腺癌、脑瘤、肺癌等均取得较满意的疗效。该药物在《中国药典》中未对其有关物质进行检测，《美国药典》、《欧洲药典》及《英国药典》都收载该品种检测方法，本文通过比较其各国药典的HPLC检测方法，结合实际情况，确立了合适的能有效监测其有关物质的检测方法。
1 仪器与试剂
Agilent 1100 液相色谱仪，包括G1354A四元泵和脱气机、G1314A紫外检测器、G1313A全自动进样器、G1316A柱温箱和Agilent Chemstation色谱工作站；AB104-S电子天平。
乙腈为色谱纯（Merk KgaA），磷酸氢二钠、柠檬酸均为国产分析纯，水为纯化水。
2 样品与对照品
供试品3批（批号为EP051201、EP051202、EP051203），均由浙江湖州展望药业有限公司提供。
甲氨蝶呤对照品 (EDQM提供，批号为n°4 ，纯度为88.6%）杂质对照品——杂质B（046K4075，Sigma）、杂质C、杂质D、杂质E及杂质H/I (EDQM提供，批号分别为n°1、n°2、n°1、 n°1，杂质测定定位用)。
3 方法与结果
3.1 方法比较
3.1.1《美国药典》[1]方法
采用色谱柱Phenomenex Luna 5u C18(2) 100A, 4.6mm×25cm；流动相以配制0.2mol/L磷酸氢二钠溶液与0.1mol/L柠檬酸溶液,以(630:370)比例混合,调PH至6.0为缓冲液；缓冲液再与乙腈以(90:10)比例混合制得。
流速：1.2ml/min；检测波长：302nm；进样量：10ul。
3.1.2《欧洲药典》[2]方法
采用色谱柱Phenomenex Luna 5u C18(2) 100A, 4.6mm×25cm；流动相A：乙腈-磷酸缓冲液=50 : 950；流动相B：乙腈-磷酸缓冲液=500 : 500；磷酸缓冲液：取无水磷酸二氢钠3.4g，用水溶解并稀释至1000ml，调pH至6.0。洗脱梯度：
时间(min)                      流动相A(%,V/V)                        流动相B(%,V/V)
0-10                                     100                                             0
10-20                              100→95                                      0→5
20-28                                95→50                                      5→50
28-37                                   50                                              50
37-38                               50→100                                    50→0
38-45                                 100                                                0
流速：2.2ml/min；检测波长：280nm；进样量20μl。
3.1.3《英国药典》[3]方法
采用色谱柱Phenomenex Luna 5u C18(2) 100A, 4.6mm×25cm；流动相：乙腈-缓冲溶液=8.5:91.5；缓冲溶液：7.8g柠檬酸和17.9g无水磷酸氢二钠，用水溶解并稀释至1000ml。
流速：1.2ml/min；检测波长：265nm；进样量20μl。
3.2结果比较
3.2.1系统适应性试验比较
A《美国药典》称取适量叶酸与适量甲氨蝶呤标准品于容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度。叶酸和甲氨蝶呤的相对保留时间约为0.35和1.0。叶酸和甲氨蝶呤的分离度R至少为8.0。甲氨蝶呤保留时间约为7.3min，理论塔板数11549，见图1
B《欧洲药典》对照溶液(d)：精密称取适量甲氨蝶呤、杂质B(4-氨基叶酸)、杂质C对照品、杂质D对照品和杂质E标准品，用0.5ml稀氨水和5ml流动相A的混合液溶解，再用流动相A稀释至100.0ml，混匀。对照溶液(e)：称取适量甲氨蝶呤峰鉴别用对照品(含杂质H和I)，用0.05ml稀氨水和1ml流动相A的混合液溶解，并用流动相A稀释至20.0ml。分别取20μl注入液相色谱仪中，甲氨蝶呤保留时间约为19.8min，理论塔板数34229，见图2、3
C《英国药典》精密称取适量甲氨蝶呤和杂质D对照品，用流动相溶解并稀释至50.0ml，混匀。杂质D和甲氨蝶呤的分离度R至少为2.0，甲氨蝶呤保留时间约为11.1min，理论塔板数12012，见图4
3.2.3有关物质测定结果
〈美国药典〉供试品溶液：浓度约1mg/ml，对照溶液：浓度约5ug/ml。按外标法计算有关物质，结果见表1-1
表1-1 〈美国药典〉有关物质的检测结果
批号              杂质B     杂质C    杂质D    RRT0.89   RRT0.95   RRT2.0    杂质E   RRT2.7    RRT3.5    总杂质
EP051201  0.02%    0.16%   0.02%      0.04%       0.03%       0.01%      0.04%   0.06%      0.08%      0.48%
EP051202  0.02%    0.16%   0.02%      0.04%       0.03%       0.03%      0.05%    0.08%     0.10%      0.52%
EP051203  0.02%    0.26%   0.02%      0.04%       0.04%       0.02%      0.04%    0.07%     0.08%      0.62%

〈欧洲药典〉供试品溶液：浓度约0.4mg/ml，对照溶液(b) 浓度约2ug/ml：对照溶液(c)：浓度约0.4ug/ml。按外标法计算有关物质， 杂质的校正因子。其中杂质E和杂质I的校正因子为0.8和1.4，其它杂质的校正因子以1计。结果见表1-2
表1-2 〈欧洲药典〉有关物质的检测结果
批号                 杂质B   杂质C   RRT0.68   RRT0.82 杂质D  RRT1.22  杂质E     RRT1.27   RRT1.30   总杂质
EP051201   0.03%    0.20%    0.00%       0.04%     0.03%   0.01%      0.10%      0.09%      0.01%      0.53%
EP051202   0.03%    0.22%    0.02%       0.04%     0.03%   0.01%      0.10%      0.13%      0.01%      0.70%
EP051203   0.04%    0.31%    0.02%       0.04%     0.03%   0.01%      0.11%      0.10%      0.01%      0.74%

〈英国药典〉供试品溶液：浓度约0.1mg/ml，对照溶液(b)：浓度约0.5ug/ml。按外标法计算有关物质，各杂质的相对保留时间分别为杂质A: 0.2； 杂质B: 0.3； 杂质C: 0.4； 杂质D: 0.8； 杂质E: 2.3。结果见表1-3
表1-3 〈英国药典〉有关物质的检测结果
批号             杂质B    杂质C     杂质D    RRT0.85    RRT0.89      RRT1.4     杂质E      RRT3.0     总杂质
EP051201  0.03%   0.11%   0.03%     0.03%         0.04%           0.02%       0.07%     0.06%      0.41%
EP051202  0.03%   0.11%   0.04%     0.03%         0.04%           0.01%       0.08%     0.08%      0.40%
EP051203  0.04%   0.20%   0.03%     0.04%         0.04%            0.02%      0.06%     0.07%      0.48%

4 讨论
4.1检测波长的选择 甲氨蝶呤紫外检测结果表明其在265nm、280nm及302nm处均有较大吸收，各国药典中的不同的检测波长对检测结果基本无影响。
4.2由于欧洲药典检测涉及较多的杂质对照品，目前杂质对照品的制备存在困难，该方法较难以推广；英国药典也需杂质D对照品；但美国药典所需的对照品是目前较容易得到的叶酸。
4.3 从各国药典的系统适应性来看，分离度均符合要求，各杂质均能检测到，但美国药典的方法最为简便，并经验证该流动相对各杂质的定位都比较明确，能准确地了解甲氨蝶呤的杂质情况。
4.4《中国药典》没有甲氨蝶呤有关物质检查项，参考各国药典该项目的分析情况，笔者认为该项目美国药典方法具有简单、高效，可操作性强等特点，适合中国目前实际，应予借鉴。